產(chǎn)品名稱：人II型膠原蛋白(ColII)ELISA試劑盒

產(chǎn)品規(guī)格：48T/96T

實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中指標(biāo)水平。用純化的指標(biāo)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入指標(biāo)，再與HRP標(biāo)記的-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（COMT）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過 洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的指標(biāo)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中指標(biāo)濃度。

組成：

（1）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；

（2）洗滌液，在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水；

（3）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；

（4）酶的底物；

（5）陰性對(duì)照品和陽性對(duì)照品（定性測定中），elisa試劑盒參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測定中）；

（6）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）

人II型膠原蛋白(ColII)ELISA試劑盒操作步驟：

1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。

2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。

3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

4. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用

5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。

7. 溫育：操作同3。

8. 洗滌：操作同5。

9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘.

10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

11. 測定：以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

為了便于計(jì)算，盡管濃度為自變量而 O.D. 值為因變量，我們繪圖時(shí)仍采用標(biāo)準(zhǔn)品的 O.D. 值作為橫坐標(biāo) （X 軸），標(biāo)準(zhǔn)品

的濃度為縱坐標(biāo) （Y 軸）。同時(shí)為了試驗(yàn)結(jié)果的直觀性，圖中提供的是原始數(shù)據(jù)而非對(duì)數(shù)值。使用對(duì)數(shù) 值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

。由于實(shí)驗(yàn)操作條件的不同（如操作者、移液技術(shù)、洗板技術(shù)和溫度條件等），標(biāo)準(zhǔn)曲線的 O.D. 值會(huì)有所差異。

所提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線僅供參考，實(shí)驗(yàn)者需要根據(jù)自已的實(shí)驗(yàn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

操作注意事項(xiàng)

1.試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲(chǔ)存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存。

2.實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。

3.不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號(hào)的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。

4.使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時(shí)，避免使用帶金屬部分的加樣器。

5.使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

6.洗滌酶標(biāo)板時(shí)應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。

7.底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時(shí)間打開蓋子。底物B對(duì)光敏感，避免長時(shí)間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值。

8.加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時(shí)間一樣。

9.按照說明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。

10．試劑盒保存：；2-8℃。

11．有效期：6個(gè)月

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