產(chǎn)品名稱：豬核因子KB(NF-KB)ELISA試劑盒

產(chǎn)品規(guī)格：48T/96T

實驗原理

本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中指標水平。用純化的指標抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入指標，再與HRP標記的-O-甲基轉移酶（COMT）抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過 洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的指標呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中指標濃度。

標本要求

1．標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融

2．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

豬核因子KB(NF-KB)ELISA試劑盒操作步驟：

1. 標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。

2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

4. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用

5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

7. 溫育：操作同3。

8. 洗滌：操作同5。

9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘.

10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

11. 測定：以空白孔調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。

ELISA的檢測目的是為了實驗提供準確的實驗依據(jù)，為了保證實驗數(shù)據(jù)的可靠性，在實驗過程中必須堅持全面的質量控制和全過程質量控制，在收集標本前都必須有一個完整的計劃

當我們在準備給貼壁細胞進行傳代的時候應該確認以下兩點：1.先把細胞從細胞培養(yǎng)箱中拿出，放在顯微鏡下觀察，確保細胞

狀態(tài)良好，沒有污染；2.觀察細胞的匯合度達到70%-90%，細胞匯合度太低或者太高時對細胞進行傳代均不利于細胞生長。

只有滿足這兩點基本條件，我們才能給細胞傳代。給細胞傳代時，首先我們棄去培養(yǎng)基，用pH=7.4的無菌的磷酸緩沖鹽溶液

（PBS）清洗細胞2-3次，動作要輕柔防止細胞脫落。清洗完細胞后再加入終濃度為0.25%的消化液消化細胞，

消化過程中把細胞放在顯微鏡下觀察，直到細胞被消化成一個一個單獨的小圓球時加入培養(yǎng)基終止細胞消化，

消化時間要把握好，消化時間太短細胞沒有消化下來，時間太長則會影響細胞活性。消化下來的細胞吹打混勻后以1:3-5的比例

分裝到新的培養(yǎng)器皿中再加入足量的培養(yǎng)基繼續(xù)擴大培養(yǎng)。

注意事項

1、每個樣本量收集體積=100ulx檢測種類，如果要做復孔，標本量收集體積=100ulx檢測種類x2
2、樣本收集后若在一周內(nèi)進行檢測可保存于2-8°C，若不及時檢測，請進行分裝，凍存于-20°或-80°C，避免反復凍融
3、試劑盒的檢測范圍不等同于樣本中待測物的濃度范圍，建議實驗前通過相關文獻預估樣本中待測物的濃度并通過預實驗確定樣本。
4、血清標本采集是應注意避免溶血，紅細胞溶解是會釋放出具有過氧化物酶活性的物質，溶血標本可能會增加非特異性顯色
5、為了保證尿液檢測的準確性，必須正確收集尿液標本和保存，收集尿液的容器必須要清潔干燥， 使用一次性的容器，避免因用藥并清潔不到而造成的污染，尿液樣本必須新鮮，留取后，應及時檢測或保存
6、標本宜在新鮮是檢測如有細菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會產(chǎn)生假陽性反應。如在冰箱中保存過久，其中可能發(fā)生聚合，間接法ELISA中樂視本底加深，
7、反復凍融會使蛋白效價降低，所以待測樣本如需多次檢測，宜少量分裝凍存

計算

以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

1．試劑盒保存：；2-8℃。

2．有效期：6個月更多產(chǎn)品詳情聯(lián)系我們

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